La strada lunga e tortuosa: avanti

Jan 26, 2024

L’accessibilità alla tecnologia di scrittura del DNA sta crescendo grazie alla commercializzazione di queste tecniche attraverso servizi che vanno dalle stampanti di DNA da banco alla sintesi personalizzata

Credito: CIPhotos/Stock/Getty Images Plus

Lo stato della sintesi del DNA è un po’ come il viaggio dell’umanità sulla luna: solo perché qualcosa è stato raggiunto in precedenza non significa che dovremmo smettere di cercare di capire come farlo meglio”.

È così che Harold P. de Vladar, CEO e fondatore del fornitore di servizi di DNA sintetico Ribbon Biolabs, vede le grandi opportunità nello spazio della sintesi del DNA. de Vladar afferma che la sintesi del DNA equivalente allo sbarco sulla Luna dell'Apollo 11 è stata il lavoro fondamentale di Craig Venter nell'assemblare il batteriofago ΦX174 da 5386 bp da brevi filamenti singoli di DNA sintetico disponibile in commercio noto come oligonucleotidi.1 Venter e il suo team al J. Craig Il Venter Institute ha costruito il genoma ΦX174 utilizzando un adattamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) chiamato assemblaggio del ciclo della polimerasi2 nel 2002-2003, subito dopo il sequenziamento del genoma umano all'inizio degli anni 2000.

Questo problema esisteva ancora fino a qualche anno fa. “Quando ero ancora un ricercatore, ho affrontato il problema di produrre DNA lungo volendo sintetizzare una libreria di piccoli genomi fagici, circa 4000 bp, e quello era un progetto impossibile. Volevo circa 250 sequenze, e questo era irrealizzabile", ha detto de Vladar.

Circa 10 anni fa, de Vladar vide che una società chiamata Twist Bioscience cominciava ad apparire nelle notizie. Arrivò alla conclusione che le persone erano ancora interessate a sintetizzare il DNA lungo. “Superficialmente, la sintesi del DNA sembrava una soluzione risolta, ma quando inizi a esaminare i dettagli, come è diminuito il costo per base per il sequenziamento e così via, ti rendi conto che la questione era lungi dall’essere risolta” (Riquadro 1).

Il costo del sequenziamento è crollato negli ultimi 10-15 anni a un ritmo che ha superato la legge di Moore. Il costo di una sequenza del genoma umano è diminuito da circa 1 milione di dollari nel 2007 a 1.000 dollari nel 2014, e oggi si avvicina ai 100 dollari, con la serie Illumina NovaSeq X e Ultima Genomics UG100 che dichiarano costi rispettivamente di 200 e 100 dollari per genoma. Ma l’accessibilità economica della sintesi personalizzata del DNA non ha tenuto il passo e il costo rimane relativamente alto. Negli ultimi anni si è osservata una tendenza generale verso la riduzione dei costi di sintesi genetica a 0,01 dollari per bp, rispetto a meno di 1-2 dollari per Gigabase offerti dagli ultimi strumenti di sequenziamento di prossima generazione.7

Nel 2018, de Vladar ha lanciato Ribbon Biolabs a Vienna, in Austria. L’azienda di sintesi del DNA può costruire in modo affidabile frammenti da 1 kb in un giorno, che possono essere assemblati in molecole più grandi di 10-20 kb. Per fare ciò, Ribbon elabora algoritmicamente una sequenza in pezzi più piccoli che vengono ordinati in un albero decisionale per identificare la migliore combinazione di oligo di 10 e 12 meri (dalla loro biobanca di quasi 80.000 oligo) per l'assemblaggio automatizzato. Il tempo di consegna effettivo, inclusa la verifica e la consegna basata sulla sequenza, per la piccola azienda (con solo poche dozzine di dipendenti), è di circa 3 giorni. L'obiettivo di de Vladar e Ribbon Biolabs è portare la sintesi genetica dall'approccio della biblioteca a 1000 kb al giorno.

Migliorando gli enzimi e gli standard di assemblaggio, sono migliorati la precisione e il numero di molecole di DNA che possono essere combinate in un unico passaggio. Negli ultimi dieci anni sono stati sviluppati numerosi nuovi e potenti metodi di assemblaggio del DNA, tra cui Gibson Assembly3. Questi metodi di assemblaggio sono stati applicati nella costruzione di un genoma batterico minimo4 e di cromosomi di lievito sintetico.5

Gli approcci di assemblaggio alla sintesi del DNA presentano diversi inconvenienti: possono essere compromessi dalle impurità degli oligonucleotidi sintetici, dalla dipendenza del metodo dalla conferma della sequenza da un singolo clone e dalla dipendenza da enzimi PCR di correzione di bozze ad alta fedeltà, che devono essere utilizzati per copiare geni per prevenire le mutazioni durante l’amplificazione.

L'approccio a più livelli di Ribbon Biolabs è limitato dalla dimensione fisica delle molecole sintetizzate. "Il DNA di 20-40 kb è una molecola davvero complessa", ha detto de Vladar. “Le reazioni non sono più così efficienti. Ma questo non è nemmeno il problema peggiore: le molecole di DNA più lunghe si rompono a causa della forza pura. L'assemblea in sé non è il problema; è la manipolazione delle molecole del DNA. È un problema che stiamo cercando di risolvere anche noi e abbiamo alcune idee in ricerca e sviluppo. Ma non stamperà solo 30 kb con la semplice pressione di un pulsante."